Второй опытный и первый серийный Ан-10 (заводской № 01–01) получил бортовой индекс СССР — Л5723. Государственные испытания проводили ведущие летчики-испытатели Кузнецов и Федоров, инженер Сорокин, а также штурманы-испытатели Житник, Н.С. Зацепа и Васильев. Облеты выполняли летчики НИИ ВВС Э.В. Голенкин, И.А. Азбиевич, Н.Я. Яковлев, С.Г. Дедух и ГВФ Захаревич. По завершении государственных испытаний в июне 1959 года самолет рекомендовали к серийному производству, и никаких отклонений в его поведении не обнаружили. Однако спустя три месяца, 18 апреля, во время испытательного полета произошла неполадка: сломался левый закрылок, что привело к потере управления. Командиру И.Е. Давыдову удалось спасти самолет и посадить его на аэродром с высоты 500 метров.
Это не было единичным случаем: в августе 1961 года для предотвращения инцидентов предложили доработать закрылки, устранив конструктивные недостатки. 29 апреля 1958 года потеряли первый Ан-10 (четвертый серийный экземпляр № 02–02); во время испытательного рейса в Воронеже отказали оба двигателя АИ-20 на правом крыле. При вынужденной посадке самолет разрушился и загорелся, в результате чего погиб бортинженер Захаров, а летчики Ларионов и Шевкуненко получили легкие травмы. Виновными в этом случае оказались летчики, которые не прошли предварительную проверку и не имели рекомендаций по пилотированию в сложных ситуациях.
27 апреля 1959 года Ан-10 совершил свой первый технический рейс, а через месяц состоялся рекламный полет по маршруту Киев — Москва — Тбилиси — Адлер — Харьков — Киев. Самолет рекламировали как экономически выгодный благодаря высокой пассажировместимости. Однако уже у Ту-104Б, который перевозил до 100 человек, экономичность оказалась выше, чем у Ан-10, хотя это относилось к полетам на больших высотах. Ан-10 же проявил себя выгодным при средних и малых высотах.
22 июля 1959 года лайнер начал свою эксплуатацию в Аэрофлоте на маршруте Москва — Симферополь. В том же году выпустили первую модификацию — Ан-10А с удлиненным фюзеляжем и новыми двигателями АИ-20А и АИ-20К, повышая пассажировместимость до 132 мест. К 1960 году на аэродроме завода в Воронеже было 26 самолетов Ан-10 и Ан-10А, для доработки которых требовалось 1490 человек, что составляло 21% рабочей силы завода. Эта доработка касалась как гражданских, так и военных самолетов.
В январе 1960 года О.К. Антонов предложил разработать модификацию Ан-10Д, указав на наличие значительных резервов в эксплуатации. Однако 26 февраля 1960 года произошла вторая катастрофа: самолет с опознавательным знаком СССР — 11180 потерпел крушение при заходе на посадку возле аэропорта Львова. Причиной бедствия стало обледенение стабилизатора, что резко снизило эффективность руля высоты. Полеты на Ан-10 и Ан-10А были приостановлены до установки надежных противообледенительных систем на заводе в Воронеже.
Воздушно-тепловая система, использующая теплый воздух от двигательных компрессоров, обогревала носки крыла, воздухозаборники и остекление кабин экипажа. Для предотвращения обледенения киля, стабилизатора, лопастей воздушных винтов, приемников воздушного давления и лобовых стекол кабины были внедрены электротермические устройства.
В Воронеже одновременно дорабатывались пассажирские и грузовые версии Ан-10. В 1961 году на серийном Ан-10А подфюзеляжный киль и шайбы горизонтального оперения заменили двумя подфюзеляжными килями. Их расположение в корме, где возникали воздушные вихри, позволило не только улучшить аэродинамические характеристики, но и устранить неприятные вибрации самолета.
Однако не все шло гладко. 21 февраля следующего года на заводском аэродроме Святошино (Киев) летчики Давыдов и Калинин, совершая аварийную посадку с работающим на полной мощности третьим двигателем, ошиблись в расчетах и разбили самолет. Левые консоли крыла и мотогондола были разрушены, фюзеляж и левая стойка шасси получили повреждения. Ремонт Ан-10 потребовал значительно больше времени.
Два месяца спустя, 29 апреля, произошла новая авария, но экипаж сумел выйти из сложной ситуации, едва не приведшей к катастрофе. Левый закрылок разрушился из-за производственного дефекта, однако быстрая реакция командира позволила завершить полет благополучно.
В начале 1961 года была сделана первая попытка установить мировой рекорд скорости на Ан-10, но она оказалась неудачной. Полет по маршруту Москва — Мелитополь — Москва завершился тем, что в конце маршрута стало понятно, что топлива недостаточно. Экипаж последовательно отключал двигатели, чтобы дотянуть до аэродрома. В итоге мировой рекорд скорости на Ан-10 был установлен 22 апреля того же года. Летчик А. Митронин пролетел замкнутый маршрут со средней скоростью 730,6 км/ч.
В марте 1963 года на Ан-10 (СССР — 11145) произошла неполадка: винт второго двигателя произвольно и неоднократно флюгировался. Поиск источника дефекта не дал результатов, и в итоге пришлось заменить силовую установку.